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利用玻璃微珠裂解酵母细胞

裂解酵母菌的最好方法是将玻璃微珠和菌细胞一起涡旋振荡进行机械破碎。此法充分利用玻璃微珠的快速转动撞击酵母菌从而机械破碎裂解酵母细胞。由此可见，这是一种强有力的裂解方法，但在裂解过程中又传输大量的能量，导致样本的变性。因此，和哺乳动物细胞的研究比较，酵母菌的免疫沉淀试验并不是一个好的方法，特别是研究蛋白质的性质和结构时，该方法是不可取的。

1.准备工作

由于免疫沉淀有多个步骤，且包括数小时孵育，因此在实验开始前必须安排好时间，注意适当利用过夜孵育的间隙。这将有助于决定何时开始裂解细胞。同时应注意，

酵母菌免疫沉淀的本底水平非常高，因此推荐进行预处理和使用蛋白酶。

2.所需溶液

PBS，裂解缓冲液(含有蛋白酶抑制剂，置冰上预冷)，玻璃微珠(500umol/L，冷藏)。

3.操作步骤

(1)4000g离心5min收集酵母菌，去上清液。重悬浮于PBS，离心，弃去PBS。

(2)将酵母团再次悬浮于少量预冷的裂解液。通常用大约3倍体积的RIPA缓冲液(150mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS和50mmol/L Tris，pH8.0)。同时应加入蛋白酶抑制剂。置冰上。

(3)玻璃微珠(直径500~mol/L)，用1mol/I盐酸和裂解缓冲液分别洗涤2次。然后置于少量裂解缓冲液内，413保存。

(4)在重悬浮的酵母细胞内加入等体积预冷的玻璃微珠

(5)剧烈涡流振荡30s，重复操作直至大部分酵母细胞裂解。

(6)将细胞裂解物连同玻璃微珠以10 000g离心5min。仔细吸取上清液盛于另一试管，置冰上。

此时，上清液可以用于下一步预处理。

4.常见问题

该方法常见问题是蛋白质抗原的变性。解决方法是用某些能破坏细胞壁的酶处理酵母菌使其形成原生质体，然后再用去污剂将其裂解。这是一个有效的方法，但酶的价格昂贵，限制了该方法常规应用于大容量标本的制备。然而对于所研究的关键蛋白的精细分析，仍不失为一个有效的方法。